图1 TaNPF7.6-A1等位变异与小麦NUE的关联分析

       为阐明TaNPF7.6-A1^mod调控小麦氮素利用效率与产量的生物学功能，研究团队创制了TaNPF7.6-A1^mod过表达、CRISPR敲除及近等基因系遗传材料，开展多生育期系统表型鉴定。结果表明，优异等位变异TaNPF7.6-A1^mod可显著优化小麦氮素分配与生长发育：拔节期可显著提升植株地上部生物量、氮素含量与积累总量，增强根系向地上部的硝酸盐转运能力；开花期可优先将氮营养分配至穗部生殖器官，同步促进营养体与生殖体生长，有效提升穗部生物量与氮素积累水平。成熟期株系表现出有效分蘖数显著增加、籽粒产量与籽粒氮积累量显著提升的优良表型，且该增效特征可稳定遗传、不受小麦遗传背景限制，充分证实TaNPF7.6-A1^mod是协同提升小麦氮利用效率与籽粒产量的关键优异等位基因（图2）。

 
图2 TaNPF7.6-A1^mod提升小麦NUE与籽粒产量的功能验证

       为进一步揭示TaNPF7.6-A1^mod提升小麦氮效率的内在机理，团队系统解析了该基因的表达模式、蛋白定位与氮转运功能特征。研究表明，TaNPF7.6-A1可特异性响应硝酸盐信号，主要在小麦地上部维管组织中表达，且优异等位型TaNPF7.6-A1^mod的转录活性显著高于普通等位型TaNPF7.6-A1^lan。亚细胞定位结果证实，两种等位基因编码的蛋白均定位于液泡膜，颠覆了多数NPF家族蛋白定位于质膜的传统认知。依托非洲爪蟾卵母细胞异源表达、15N同位素示踪及NMT活体离子检测技术，研究明确TaNPF7.6-A1可介导液泡硝酸盐向细胞质外排，且TaNPF7.6-A1^mod的硝酸盐转运活性远优于普通等位型。长期氮素培养与短期同位素吸收试验均验证，携带TaNPF7.6-A1^mod的株系根系吸氮能力、根向地上部氮素转运效率及植株氮积累量显著提升，敲除株系则呈现相反表型。该结果阐明了TaNPF7.6-A1通过调控液泡氮素再分配，正向调控小麦整体氮素吸收与转运的全新功能机制（图3）。

 
图3 TaNPF7.6-A1介导液泡硝酸盐外排并影响小麦氮素利用

       为揭示两个TaNPF7.6-A1等位基因表达差异的调控机理，团队筛选并验证了互作转录因子TaEIL3。通过酵母单杂、凝胶迁移、染色质免疫共沉淀及双荧光素酶等多重实验证实，TaEIL3可直接结合TaNPF7.6-A1启动子并激活基因表达，且两种等位基因的启动子对TaEIL3的转录响应无明显差异。功能试验表明，TaEIL3正向调控小麦硝态氮吸收与根冠转运能力，促进植株生长与氮素积累；敲除该基因则显著抑制小麦氮素利用与生长发育。利用病毒沉默技术特异性抑制TaNPF7.6-A1mod表达后，TaEIL3的增效功能被显著削弱，证明TaEIL3主要通过TaEIL3-TaNPF7.6-A1通路调控小麦氮素转运。田间试验进一步验证，TaEIL3过表达可显著提升小麦氮积累水平、籽粒氮含量与单株产量，是调控小麦氮高效与产量形成的正向关键因子（图4）。

 
图4 TaEIL3直接激活TaNPF7.6-A1表达调控小麦NUE

       为解析TaNPF7.6-A1的分子调控网络，研究团队以TaNPF7.6-A1^mod为诱饵开展酵母膜蛋白双杂交筛选，获得38个候选互作蛋白。团队聚焦关键蛋白TaJAZ1，通过酵母点对点验证、荧光素酶互补、GST pull-down、免疫共沉淀及双分子荧光互补等多种体内外实验，证实TaJAZ1可在细胞质中与两种TaNPF7.6-A1等位蛋白发生物理互作，且与优异等位型TaNPF7.6-A1^mod的结合能力显著更强。亚细胞定位与核质分离实验进一步表明，相较于普通等位型与野生型材料，TaNPF7.6-A1^mod可显著降低TaJAZ1的核质分布比例，有效将TaJAZ1滞留于细胞质中，实现对下游调控蛋白的空间调控（图5）。

 
图5 TaNPF7.6-A1等位变异影响TaJAZ1的核质分布

       进一步研究发现，TaJAZ1能够在细胞核内与TaEIL3发生互作。转录激活与凝胶迁移试验证实，TaJAZ1可阻碍TaEIL3结合TaNPF7.6-A1启动子，抑制TaEIL3的转录激活效应。单独检测两种等位基因启动子，其转录激活水平并无明显差异；但共表达TaNPF7.6-A1蛋白后，TaNPF7.6-A1^mod组的启动子活性显著高于TaNPF7.6-A1^lan组。这说明 TaNPF7.6-A1^mod凭借与TaJAZ1更强的相互作用，将更多TaJAZ1滞留于细胞质，解除其对核内TaEIL3的抑制作用，进而增强自身基因转录，形成一套正反馈调控通路。烟草叶片硝酸盐积累试验也验证了该等位变异带来的功能差异。敲除TaJAZ1可上调TaNPF7.6-A1^mod表达，提升小麦硝态氮吸收与转运能力。田间试验结果显示，无论正常供氮还是低氮条件，TaJAZ1敲除株系的氮积累量、籽粒氮含量及单株产量均显著优于野生型，证明TaJAZ1是小麦氮利用效率与籽粒产量的负调控因子（图6）。

 
图6 TaJAZ1通过抑制TaEIL3转录活性负调控TaNPF7.6-A1表达

       田间小区试验结果表明，无论正常供氮还是低氮栽培条件，TaNPF7.6-A1^mod均可在不同小麦遗传背景下显著提升籽粒产量、植株及籽粒氮素积累水平；携带优异等位型的近等基因系NIL^mod性状显著优于普通等位型材料NIL^lan，稳产增效效果稳定可靠。全球种质资源分析显示，TaNPF7.6-A1^mod广泛富集于现代育成品种中，而原始等位型TaNPF7.6-A1^lan多存在于传统地方种质，且该优异等位变异在地中海高产麦区高度聚集，与全球小麦高产区高度重合。针对我国小麦育种材料的动态分析表明，TaNPF7.6-A1^mod的育种利用频率由1980年前的22.22%大幅提升至2011–2020年的81.05%，已成为我国现代小麦品种的主流优势等位基因。综上，TaNPF7.6-A1^mod是小麦氮高效与高产协同改良过程中被长期正向选择的关键优异变异，具备极高的分子育种应用潜力与推广价值（图7）。

 
图7 TaNPF7.6-A1^mod的育种潜力与地理分布特征

       该研究形成四项突破性创新成果。其一，创新整合候选基因关联分析与全基因组关联分析策略，系统解析331个小麦NPF家族基因的变异特征，从244份核心种质中精准鉴定氮高效关键基因TaNPF7.6-A1，有效突破传统定位方法区间宽泛、候选基因繁杂、验证难度大的技术瓶颈，大幅提升作物氮高效基因的挖掘精度与筛选效率。其二，刷新了对NPF家族基因功能的认知，区别于多数定位于质膜、参与硝酸盐直接吸收转运的家族成员，该研究证实TaNPF7.6-A1定位于液泡膜，主要介导液泡硝酸盐向细胞质外排，参与植株体内氮素储存与再利用过程，丰富了植物氮素转运调控的功能机制。其三，首次构建TaEIL3-TaJAZ1-TaNPF7.6-A1全新分子调控模块，揭示了等位基因功能分化的新型机制：优异等位型TaNPF7.6-A1^mod可通过更强的蛋白互作滞留抑制因子 TaJAZ1，解除其对转录激活因子TaEIL3的抑制作用，形成独特的自我正向转录调控通路，阐明了两种等位基因表达与功能差异的核心机理。其四，多点田间试验证实，TaNPF7.6-A1^mod可在不同遗传背景、不同氮素水平下，协同提升小麦籽粒产量与籽粒氮浓度，打破了产量与品质的负相关桎梏。种质进化分析表明，该优异等位变异在全球高产麦区高度富集，且在我国现代小麦育种中被持续正向选择、应用频率大幅攀升，为小麦节氮高产分子育种提供了极具应用价值的核心基因资源与理论支撑。
       我院许为钢院士、河南省农业科学院齐学礼研究员为该论文的通讯作者。我院博士生江迪、河南省农业科学院彭超军副研究员为本论文的共同第一作者。相关工作还得到了中国农业科学院作物科学研究所夏兰琴研究员，中国科学院遗传与发育生物学研究所童依平研究员，华中农业大学章元明教授，河南大学周云教授，我院王道文研究员和郑宏远研究员提供的帮助和指导。该研究获得国家重点研发计划（2022YFD1200204）、河南省科技攻关项目（262102111135）、河南省科技研发计划联合基金（222301420025、232301420027）、神农种业实验室“一流课题”（SN01-2022-01）、国家现代农业产业技术体系专项（CARS-03）以及河南省重大科技专项（231100110100）等项目的资助。