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蛋白质是生命活动中的核心功能分子，通过识别并改造关键氨基酸位点，可以提升蛋白活性、稳定性或赋予其新的功能。因此，如何高效、精准地实现蛋白质定向改造，是生物学、生物技术和农业育种领域的重要挑战。目前，定向进化和结构引导的理性设计是蛋白质工程中的主要策略，但前者通常依赖大规模突变与筛选，成本高、周期长，尤其难以应用于复杂的高等动、植物中；后者则高度依赖结构与功能关系的专业认知，且难以实现对复杂蛋白质体系有益突变的预测。
近年来，人工智能（Artificial Intelligence, AI），尤其是深度学习技术的发展，为蛋白质工程带来了新的计算设计路径。通过学习海量蛋白质序列和结构数据中的规律，AI模型能够在巨大的蛋白质空间中预测潜在功能增强突变，推动蛋白质工程从传统的“实验试错”逐步走向“计算设计”。然而，现有方法仍存在明显局限：无需目标蛋白实验数据的零样本（Zero-shot）策略是理想的方法，但其准确率和效率相对较低；少样本（Few-shot）方法虽然能够提高预测能力，却依赖大量目标蛋白实验数据，并需要反复进行“设计—实验—优化”的闭环过程。因此，如何建立一种高效、精准的零样本策略，在无需目标蛋白实验数据的情况下，仅通过少量实验验证获得高成功率功能增强突变，是蛋白质定向进化走向广泛应用亟待解决的关键问题。
针对这一问题，我院作物基因组学系（麦类基因组学和分子育种团队）姬祥教授、王道文研究员，智慧农业系（水稻创新团队）陈震教授等在《Molecular Cell》发表题为“Simplifying in silico protein evolution with minimal screening by unZipro”的研究论文，提出了一种面向蛋白质定向进化的人工智能新策略unZipro (unsupervised Zero-shot inverse folding framework for protein evolution) (图1)。该策略通过结合蛋白质普适进化规律和家族特异性结构约束，实现了AI模型从“通用预测器”向蛋白质“进化导航仪”的转变。研究团队利用24,501个非冗余蛋白质结构预训练图神经网络模型，学习蛋白质序列与三维结构之间的基本规律；进一步引入元学习策略，使模型能够快速适应不同蛋白家族，捕捉其特异性的序列—结构约束。在ProteinGym数据集（包含217组深度突变扫描实验、186种蛋白质以及约246万个突变）测试中，unZipro使预训练模型预测性能提升12.4%。与ProteinMPNN、ESM-IF1、AiCE、EVOLVEpro、MapDiff等9种代表性方法相比，unZipro在保持轻量化和高计算效率的同时，表现出更优的突变效应预测能力和高适应度变体识别能力，并在不同物种和功能类型蛋白质中展现出良好的泛化能力。
近年来，人工智能（Artificial Intelligence, AI），尤其是深度学习技术的发展，为蛋白质工程带来了新的计算设计路径。通过学习海量蛋白质序列和结构数据中的规律，AI模型能够在巨大的蛋白质空间中预测潜在功能增强突变，推动蛋白质工程从传统的“实验试错”逐步走向“计算设计”。然而，现有方法仍存在明显局限：无需目标蛋白实验数据的零样本（Zero-shot）策略是理想的方法，但其准确率和效率相对较低；少样本（Few-shot）方法虽然能够提高预测能力，却依赖大量目标蛋白实验数据，并需要反复进行“设计—实验—优化”的闭环过程。因此，如何建立一种高效、精准的零样本策略，在无需目标蛋白实验数据的情况下，仅通过少量实验验证获得高成功率功能增强突变，是蛋白质定向进化走向广泛应用亟待解决的关键问题。
针对这一问题，我院作物基因组学系（麦类基因组学和分子育种团队）姬祥教授、王道文研究员，智慧农业系（水稻创新团队）陈震教授等在《Molecular Cell》发表题为“Simplifying in silico protein evolution with minimal screening by unZipro”的研究论文，提出了一种面向蛋白质定向进化的人工智能新策略unZipro (unsupervised Zero-shot inverse folding framework for protein evolution) (图1)。该策略通过结合蛋白质普适进化规律和家族特异性结构约束，实现了AI模型从“通用预测器”向蛋白质“进化导航仪”的转变。研究团队利用24,501个非冗余蛋白质结构预训练图神经网络模型，学习蛋白质序列与三维结构之间的基本规律；进一步引入元学习策略，使模型能够快速适应不同蛋白家族，捕捉其特异性的序列—结构约束。在ProteinGym数据集（包含217组深度突变扫描实验、186种蛋白质以及约246万个突变）测试中，unZipro使预训练模型预测性能提升12.4%。与ProteinMPNN、ESM-IF1、AiCE、EVOLVEpro、MapDiff等9种代表性方法相比，unZipro在保持轻量化和高计算效率的同时，表现出更优的突变效应预测能力和高适应度变体识别能力，并在不同物种和功能类型蛋白质中展现出良好的泛化能力。
图1 unZipro策略及应用示意图
unZipro实现基因编辑工具快速改造
基因编辑技术的发展极大推动了生命科学研究和农业育种应用。其中，CRISPR/Cas核酸酶、碱基编辑器（base editor, BE）以及引导编辑器（prime editor, PE）等工具的性能，很大程度取决于核心蛋白组分的活性优化。常规改造这些蛋白的方法通常需要筛选大规模的突变体，耗时费力。为了验证unZipro策略能否快速、高效地实现对不同基因编辑蛋白的定向进化，研究人员选择了腺嘌呤碱基编辑器(ABE)，CRISPR/Cas9，CRISPR/CasΦ2和PE进行研究。
研究团队首先利用ABE中的关键脱氨酶TadA8e验证unZipro的零样本蛋白进化能力。通过AI预测和少量候选验证，研究人员仅需筛选6个候选突变，就获得了4个有益突变，成功率为66.6%，其中高活性TadA8e（T83N）变体在小麦原生质体和转基因体系中显著提高了碱基编辑效率，并降低整体脱靶水平。分子动力学模拟进一步揭示，T83N突变能够形成新的氢键相互作用，稳定局部催化环境，并增强蛋白与DNA底物之间的结合，为其活性和特异性的提升提供了结构解释。随后，研究团队将unZipro应用于不同类型CRISPR编辑蛋白优化。在SpCas9改造中，获得的D1180G突变使小麦编辑效率最高提高12.8倍；针对小型核酸酶CasΦ2，进一步结合T5外切酶优化获得增强型T5E-CasΦ2编辑器，编辑效率最高提升27.9倍，并保持较高编辑特异性。
虽然该策略在单点有益突变预测中具有较高的准确率，但如何整合有益的单点突变，实现高效、协同的多位点突变组合设计是蛋白质定向改造的一个关键瓶颈。研究团队以PE为例，结合不同构象状态下的PE结构信息，利用unZipro分别预测MMLV逆转录酶在不同功能状态下的潜在有利突变，并进一步综合进化约束、空间邻近关系和残基间相互作用，对不同位点的组合效应进行预测，从而将传统的“大规模组合筛选”转变为“少量候选组合的精准筛选”。结果显示，unZipro预测获得的PE候选突变具有较高成功率。在进一步筛选少量双位点组合突变后，获得了具有明显协同增效作用的PE变体，其中R253K/T246H组合表现出优异的编辑性能，在多个小麦内源基因位点实现编辑效率的提升。全基因组测序和分子动力学分析表明R253K/T246H组合突变有效的提高PE系统编辑效率的同时保持其高特异性。
基于这些研究结果，研究团队成功构建了ABE8eplus、ABE9plus、CRISPR/Cas9plus、CRISPR/CasΦ2plus和PEUltra基因编辑新工具，该策略为高效、精准的基因编辑工具创制提供了一种新的技术路径。
植物功能蛋白的快速进化
如果说基因编辑工具的进化验证了unZipro对蛋白工程任务的适用性，那么研究团队更加关注的另一个问题是：对于没有成熟高通量筛选体系和被解析结构的植物功能蛋白，unZipro是否同样能够帮助其高效、快速完成定向进化？与许多微生物酶不同，植物转录因子、抗病、代谢调控等蛋白的功能往往需要在植物细胞甚至完整植株中进行验证，很难一次性建立成千上万个变体的大规模筛选体系。因此，“少做实验即可找到有效突变”对于植物蛋白质工程具有更加直接的现实意义。
研究团队以萤火虫荧光素酶为对象，仅验证7个候选突变即获得4个高适应度变体，其中LUC (M164I)活性达到野生型的4.1倍。针对水稻转录因子OsPHR2和OsNAC3，unZipro结合预测结构分别获得多个功能增强变体，成功率分别为50%和70%，其中代表性突变体的转录激活能力提高约4.7倍和3.6倍，这也表明了即使缺乏实验解析的蛋白质三维结构，unZipro仍可结合预测结构有效识别潜在有益突变。研究团队进一步将unZipro应用于植物抗病相关蛋白大麦甲硫氨酸合酶HvMS1，验证其能否在更复杂的生物学功能背景下实现蛋白性能优化。通过对11个候选突变进行实验筛选，研究人员获得了5个抗病毒能力显著增强的HvMS1变体。实验分析表明，这些变体的表达水平与野生型无明显差异，其抗病毒能力增强主要源于蛋白自身活性的提升，且对RNA病毒PVX和DNA病毒BSCTV表现出广谱抗性。
总体而言，本研究提出了unZipro这一面向蛋白质定向进化的零样本人工智能设计框架，通过融合蛋白质普适进化规律与家族特异性结构约束，实现了从海量突变空间中快速定位高潜力功能变体。该策略突破了传统定向进化依赖大规模突变库和高通量筛选的限制，仅需验证少量候选突变即可获得高成功率的功能增强变体，并在源于病毒、细菌、动物和植物的九类蛋白质工程任务中得到验证，平均成功率为61%，最高在基因编辑融合蛋白中实现28倍性能提升，创建了高效且特异的基因编辑新工具。更重要的是，unZipro兼容实验解析结构和AlphaFold预测结构，拓展了人工智能驱动蛋白质设计在复杂植物蛋白和农业生物技术中的应用边界。研究团队还开发在线服务器 (https://ai4bio.online/unZipro/)，帮助无编程经验的实验生物学家更加便捷地开展人工智能辅助的蛋白质设计。该研究为构建低成本、高效率、可推广的智能化蛋白质工程体系提供了新范式，有望推动人工智能技术在生物制造、生命健康和精准育种等领域的广泛应用。
河南农业大学博士研究生秦兆辉、赵三增、邓兆龙和河南大学司小敏教授为论文共同第一作者，河南农业大学姬祥、陈震教授，王道文研究和莫纳什大学宋江宁教授为共同通讯作者。河南农业大学李成伟教授，深圳大学吴松教授、付蕾研究员和李金辉博士，帝国理工学院James Murray教授为该研究提供了重要帮助。特别感谢中国科学院遗传与发育生物学研究所高彩霞研究员和墨尔本大学Robin Gasser院士为研究提供的重要意见。该研究得到国家重点研发计划、国家自然科学基金、河南省自然科学基金、中原英才计划和深圳市医学研究专项基金的资助。
基因编辑技术的发展极大推动了生命科学研究和农业育种应用。其中，CRISPR/Cas核酸酶、碱基编辑器（base editor, BE）以及引导编辑器（prime editor, PE）等工具的性能，很大程度取决于核心蛋白组分的活性优化。常规改造这些蛋白的方法通常需要筛选大规模的突变体，耗时费力。为了验证unZipro策略能否快速、高效地实现对不同基因编辑蛋白的定向进化，研究人员选择了腺嘌呤碱基编辑器(ABE)，CRISPR/Cas9，CRISPR/CasΦ2和PE进行研究。
研究团队首先利用ABE中的关键脱氨酶TadA8e验证unZipro的零样本蛋白进化能力。通过AI预测和少量候选验证，研究人员仅需筛选6个候选突变，就获得了4个有益突变，成功率为66.6%，其中高活性TadA8e（T83N）变体在小麦原生质体和转基因体系中显著提高了碱基编辑效率，并降低整体脱靶水平。分子动力学模拟进一步揭示，T83N突变能够形成新的氢键相互作用，稳定局部催化环境，并增强蛋白与DNA底物之间的结合，为其活性和特异性的提升提供了结构解释。随后，研究团队将unZipro应用于不同类型CRISPR编辑蛋白优化。在SpCas9改造中，获得的D1180G突变使小麦编辑效率最高提高12.8倍；针对小型核酸酶CasΦ2，进一步结合T5外切酶优化获得增强型T5E-CasΦ2编辑器，编辑效率最高提升27.9倍，并保持较高编辑特异性。
虽然该策略在单点有益突变预测中具有较高的准确率，但如何整合有益的单点突变，实现高效、协同的多位点突变组合设计是蛋白质定向改造的一个关键瓶颈。研究团队以PE为例，结合不同构象状态下的PE结构信息，利用unZipro分别预测MMLV逆转录酶在不同功能状态下的潜在有利突变，并进一步综合进化约束、空间邻近关系和残基间相互作用，对不同位点的组合效应进行预测，从而将传统的“大规模组合筛选”转变为“少量候选组合的精准筛选”。结果显示，unZipro预测获得的PE候选突变具有较高成功率。在进一步筛选少量双位点组合突变后，获得了具有明显协同增效作用的PE变体，其中R253K/T246H组合表现出优异的编辑性能，在多个小麦内源基因位点实现编辑效率的提升。全基因组测序和分子动力学分析表明R253K/T246H组合突变有效的提高PE系统编辑效率的同时保持其高特异性。
基于这些研究结果，研究团队成功构建了ABE8eplus、ABE9plus、CRISPR/Cas9plus、CRISPR/CasΦ2plus和PEUltra基因编辑新工具，该策略为高效、精准的基因编辑工具创制提供了一种新的技术路径。
植物功能蛋白的快速进化
如果说基因编辑工具的进化验证了unZipro对蛋白工程任务的适用性，那么研究团队更加关注的另一个问题是：对于没有成熟高通量筛选体系和被解析结构的植物功能蛋白，unZipro是否同样能够帮助其高效、快速完成定向进化？与许多微生物酶不同，植物转录因子、抗病、代谢调控等蛋白的功能往往需要在植物细胞甚至完整植株中进行验证，很难一次性建立成千上万个变体的大规模筛选体系。因此，“少做实验即可找到有效突变”对于植物蛋白质工程具有更加直接的现实意义。
研究团队以萤火虫荧光素酶为对象，仅验证7个候选突变即获得4个高适应度变体，其中LUC (M164I)活性达到野生型的4.1倍。针对水稻转录因子OsPHR2和OsNAC3，unZipro结合预测结构分别获得多个功能增强变体，成功率分别为50%和70%，其中代表性突变体的转录激活能力提高约4.7倍和3.6倍，这也表明了即使缺乏实验解析的蛋白质三维结构，unZipro仍可结合预测结构有效识别潜在有益突变。研究团队进一步将unZipro应用于植物抗病相关蛋白大麦甲硫氨酸合酶HvMS1，验证其能否在更复杂的生物学功能背景下实现蛋白性能优化。通过对11个候选突变进行实验筛选，研究人员获得了5个抗病毒能力显著增强的HvMS1变体。实验分析表明，这些变体的表达水平与野生型无明显差异，其抗病毒能力增强主要源于蛋白自身活性的提升，且对RNA病毒PVX和DNA病毒BSCTV表现出广谱抗性。
总体而言，本研究提出了unZipro这一面向蛋白质定向进化的零样本人工智能设计框架，通过融合蛋白质普适进化规律与家族特异性结构约束，实现了从海量突变空间中快速定位高潜力功能变体。该策略突破了传统定向进化依赖大规模突变库和高通量筛选的限制，仅需验证少量候选突变即可获得高成功率的功能增强变体，并在源于病毒、细菌、动物和植物的九类蛋白质工程任务中得到验证，平均成功率为61%，最高在基因编辑融合蛋白中实现28倍性能提升，创建了高效且特异的基因编辑新工具。更重要的是，unZipro兼容实验解析结构和AlphaFold预测结构，拓展了人工智能驱动蛋白质设计在复杂植物蛋白和农业生物技术中的应用边界。研究团队还开发在线服务器 (https://ai4bio.online/unZipro/)，帮助无编程经验的实验生物学家更加便捷地开展人工智能辅助的蛋白质设计。该研究为构建低成本、高效率、可推广的智能化蛋白质工程体系提供了新范式，有望推动人工智能技术在生物制造、生命健康和精准育种等领域的广泛应用。
河南农业大学博士研究生秦兆辉、赵三增、邓兆龙和河南大学司小敏教授为论文共同第一作者，河南农业大学姬祥、陈震教授，王道文研究和莫纳什大学宋江宁教授为共同通讯作者。河南农业大学李成伟教授，深圳大学吴松教授、付蕾研究员和李金辉博士，帝国理工学院James Murray教授为该研究提供了重要帮助。特别感谢中国科学院遗传与发育生物学研究所高彩霞研究员和墨尔本大学Robin Gasser院士为研究提供的重要意见。该研究得到国家重点研发计划、国家自然科学基金、河南省自然科学基金、中原英才计划和深圳市医学研究专项基金的资助。